۲-۴ اسکلت پایه فلاونوئید ۲۹
۲-۵ مسیر بیوسنتز آرتمیزنین ۳۲
۲-۶ شکل شماتیک از فعال شدن سیستم دفاعی گیاه در اثر تیمار با محرک ۵۵
۵-۱ اثر هورمون ۲,۴-D بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی ۸۳
۵-۲ اثر هورمون BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی ۸۳
۵-۳ اثر متقابل هورمون ۲,۴-D و BAP بر وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه برگی ۸۳
۵-۴ کالوس حاصل از ریزنمونه برگ ۸۳
۵-۵ کالوس حاصل از ریزنمونه ساقه ۸۳
۵-۶ اثر هورمون BAP بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه برگی ۸۷
۵-۷ اثر هورمون Kin بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه برگی ۸۷
۵-۸ اثر هورمون BAP بر باززایی غیرمستقیم ریزنمونه ساقه ۸۷
۵-۹ گیاهچه حاصل از باززایی غیرمستقیم برگ ۸۸
۵-۱۰ گیاهچه حاصل از باززایی غیرمستقیم ساقه ۸۸
۵-۱۱ اثر متیل جاسمونات بر میزان آرتمیزنین در کالوس ۸۹
۵-۱۲ میزان پروتئین در نمونه های شاهد و تیمار شده باMJA (µM50 و ۱۵۰ ) و SA (mg/50 ml culture 2و۴) در زمان های مختلف (۱۲۰ و ۴۸ ساعت) ۹۱
۵-۱۳ فعالیت آنزیمASC در نمونه های شاهد و تیمار شده باMJA (µM50 و ۱۵۰ ) و SA (mg/50 ml culture 2و۴) در زمان های مختلف (۱۲۰ و ۴۸ ساعت) ۹۲
فهرست جدول ها صفحه
۲-۱ گروه های اصلی ترکیبات مهم تجاری حاصل از گیاهان ۵۱
۳-۱ مطالعات کشت بافت A.annua 61
۳-۲ مواد تشکیل دهنده محیط پایه Ms 71
۵-۱ اثر تیمارهای هورمونی بر درصد کالوس دهی ۸۲
۵-۲ نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در القای کالوس ۸۲
۵-۳ اثر تیمارهای هورمونی بر درصد باززایی ۸۵
۵-۴ نتایج بدست آمده از محیط های مختلف در باززایی غیرمستقیم ۸۷
۵-۵ میزان آرتمیزنین در کالوس تیمار شده با µM 50 متیل جاسمونات و شاهد پس از ۱۲۰ ساعت ۸۹
۵-۶ اندازه گیری پروتئین بدست آمده از کالوس ۹۰
۵-۷ فعالیت آنزیم ASC پس از اعمال تیمار ۹۲
مقدمه
۱-۱- مقدمه
امروزه متابولیت های ثانویه[۱] به عنوان منبعی برای تولید دارو، افزودنی های غذایی، طعم دهنده ها و درمان بیماری ها به کار می روند (Sairam, R. et al. 2002). قدیمی ترین اطلاعات استفاده از گیاهان به عنوان دارو از سومریان و مصریان مربوط به حدود ۱۵۵۰ سال تا ۳ هزار سال پیش از میلاد مسیح می باشد (اصغری، غ ر. ۱۳۸۵). ترکیبات طبیعی را می توان به عنوان ترکیبات راهنما برای طراحی منطقی داروهای جدید، توسعه الگو برداری از سنتز آنها و کشف اثرات درمانی جدید مورد استفاده قرار داد (اصغری، غ ر. ۱۳۸۵). گیاه A.annua منبع یک داروی مهم گیاهی سنتی در چین به نام Qing Hao است که در حدود بیش از ۲۰۰۰ سال به عنوان داروی کاهنده تب استعمال می شده است. ترپنوئیدها و فلاونوئیدهای متعدد استخراج شده از A.annua فعالیت ضد سلولی[۲] مهمی را در هنگام آزمایش روی تومور در انسان نشان داده است. در بین این مواد، آرتمیزین و کورستاژتین[۳] به عنوان ماده موثر در این فعالیت ضدسلولی مهم اثبات شده اند. همچنین عصاره های استخراج شده از قسمت های هوایی گیاه A.annua که در مجاورت هوا خشک شده اند، دارای فعالیت تعدیل مصونیت از طریق تکثیر لنفوسیت نوع T بوده اند. بر اساس مطالعات انجام شده ۲۴ ترکیب در اسانس گونه A.annua مشاهده شده است. ترکیبات اصلی این اسانس، آرتمیزیا کتون، ۱و۸- سینئول، پینوکاروون، بتا–سلینن، کامفور و گاما- مورولن می باشند) مینا ربیعی، ۱۳۸۲). یکی از مهمترین ترکیبات دارویی این گیاه، آرتمیزینین[۴] از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم[۵] عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهند. از آنجا که در گزارشات سازمان بهداشت جهانی موارد مقاوم این انگل به داروهای فعلی نظیر کلروکوئین، سولفادوکسین و پرپمتامین یافت شده، به همین دلیل تولید تجاری و انبوه آن مورد توجه خاصی قرار گرفته استKalyman , D. L. 1985)). عملکرد نسبتاٌ کم [۰۸/۱ – ۰۱/۰ درصد] این ماده در گیاه محدودیت عمده ای در تولید تجاری آن است. تغییرات در شرایط کشت و محیط رشد در کشت های سلولی و تغییر سطوح هورمون های رشد در کشت بافت به منظور بالا بردن مقدار آرتمیزنین چندان موفق نبوده است و از طرف دیگر به دلیل منابع محدود و مشکلات ساخت مصنوعی – شیمیایی این ماده مورد توجه قرار نگرفته است. به همین دلیل در سالهای اخیر تلاش های زیادی برای افزایش آرتمیزنین از گیاه فوق به کمک الیسیتورها صورت گرفته است(Archana, G. et al. 2002). کاربرد محرک های زنده[۶] (مانند: متیل جاسمونات[۷] و عصاره مخمر[۸]) یک استراتژی مهم در تغییر میزان فعالیت آنزیم های دخیل در مسیر بیوسنتز متابولیت های ثانویه و در نتیجه افزایش تولید آنها می باشد (Zaho, J. et al. 2001).
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
بنابر این در این تحقیق اثرات محرک های[۹] مختلف (متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید[۱۰]) بر تولید آرتمیزنین، تجمع پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز[۱۱] مورد بررسی قرار گرفته است.
۱-۲-اهداف پژوهش:
- معرفی بهترین هورمون جهت کالوس زایی در گیاه درمنه خزری.
- معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.
- معرفی بهترین هورمون جهت باززایی.
- معرفی بهترین غلظت هورمون جهت کالوس زایی.
- معرفی بهترین محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.
- معرفی بهترین غلظت محرک به منظور حداکثر تولید آرتمیزنین.
- بررسی تغییرات میزان پروتئین و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در برابر محرک.
۱-۲-ویژگی های گیاه شناسیArtemisia annua
درمنه (A.annua)از دولپه ای ها، راسته Asterales، خانواده Asteraceae و قبیله Anthemedeae است. گیاهی است یکساله، راست (برافراشته)، بدون کرک یا دارای کرک های پراکنده، ساقه منفرد به ارتفاع ۱۰۰-۳۰ سانتی متر، برگها ۵-۳ ×۴-۲ سانتی متر، دارای دمبرگی بلند، دو بار شانه ای منقسم، پانیکول بسیار بزرگ با شاخه های به طور تقریبی ۲۵ سانتی متر، کلاپرکها متعدد، دمگل دار، واژگون، کروی، نهنج بدون کرک، جام گل لوله ای باز، پنج دندانه ای، زردرنگ می باشد که در گرگان، مازندران و گیلان از پراکنش نسبتا وسیعی برخوردار است.)مظفریان، ولی ا…، ۶۸-۱۳۶۷(
گیاهشناسی تیره آستراسه (کاسنی)[۱۲]
نام لاتین کاسنی از Aster، که یک واژه یونانی به معنای ستاره می باشد مشتق شده است و کمپوزیته، یک نام قدیمی اما هنوز معتبر برای این تیره است که اشاره به نوعی گل آذین مشخص دارد که از ویژگی های تیره آستراسه به حساب می آید (Cronquist 2001).
بزرگترین جنس های این تیره Senecio (1000 گونه)، Vernonia (1000گونه)، Centaurea (700 گونه)، Cousinia (600 گونه)، Helichrysum (550 گونه) و Artemesia (550 گونه) هستند (Wagenitz 1976).
اکثر اعضای تیره کاسنی ساختار علفی دارند، اما تعداد قابل توجهی نیز به شکل درختچه، تاک و درخت دیده می شوند (Judd, Campbell et al. 1999).
فرم رویشی گیاهان این تیره به صورت علفی یا خشبی، یکساله تا چند ساله است.
سیستم ریشه ای آنها راست ریشه[۱۳] با ساقه مستقیم و دارای برگ های متناوب، غالباٌ با بریدگی های گوناگون است. گل ها به صورت گلهای کناری در کپه های ناجور جنس ماده یا ماده عقیم، گلهای طبقی (لوله ای) نر ماده یا به ندرت ماده یا نر عقیم، عموماٌ ماده یا به تخمدان تقلیل یافته و از نظر عمل نر با لوله ای یا به ندرت لوله ای – نخی شکل، غالباٌ زرد یا به ندرت سبز مایل به قرمز (مظفریان ۱۳۸۷).
جام گل در این تیره سفید، قرمز یا زرد، زبانه ای یا پهن شده نامنظم و ۲ تا ۳ لوبه یا لوله ای باریک و با شکافهای نامنظم و دندانه دار یا به ندرت کاملاٌ لوله ای است.
میوه ها به صورت فندقه هم شکل یا به ندرت ناجور شکل، ۲ تا ۱۰ رگه ای یا ۱ تا ۳ باله، استوانه ای یا با سطح پشتی- شکمی فشرده هستند. کلاله در گل های این تیره وجود ندارد یا وجود دارد، کاهکی، تاج مانند یا گوشک دار مورب، به ندرت متشکل از فلس های بسیار باریک متعدد است. کیسه های بساک با قاعده دم دار یا به ندرت بدون دم، با رأس زایده دار است. خامه گل سربریده، با رأس قلم موئی، با کلاله خطی کناری است.
شکل ۲-۱: ساختار گل در تیره کاسنی
(Australian National Botanic Gardens 2011)
۲-۱-۲-پراکنش جغرافیایی تیره آستراسه (کاسنی)
این تیره در سراسر جهان به استثنای قطب جنوب و قطب شمال توزیع شده، ودر مناطق خشک [۱۴] و نیمه خشک [۱۵] ، عرض های جغرافیایی معتدل ، نیمه گرمسیری و پایین شایعترین پوشش گیاهی است (Valles and McArthur 2000).
۲-۱-۳-گیاهشناسی جنس آرتمیزیا (درمنه)
تا کنون بیش از ۵۰۰ گونه برای این سرده شناسایی شده است (LI,Jiang et al.2012). فرم رویشی درمنه، علفی یا خشبی و بوته مانند ،یکساله دوساله تا چند ساله هستند. دارای سیستم ریشه ای، راست ریشه با ساقه برافراشته یا ایستاده، گاهی افتان و گسترده روی زمین، ساقه ها متعدد، در برخی گونه ها بدون انشعاب است. برگ هامتناوب، بدون کرک یا به اشکال گوناگون کرک دار، کرک ها ۲ شاخه، به ندرت ستاره ای یا ساده، در بالا اغلب حاوی کرک های غده ای منقوط بدون پایک، پهنک شانه ای بخش یا شانه ای بریده یا ۲ تا ۴ بار شانه ای بخش، به ندرت ساده، دندانه دار، قاعده ای ها دمبرگ دار، برگ های ساقه ای اغلب بدون دمبرگ یا دمبرگ کوتاه دارند. گل آذین در گل های جنس آرتمیزیا با شمای عمومی گل آذین پانیکول یا سنبله ای- خوشه ای است.
گل های جنس آرتمیزیا همگی لوله ای، در کپه های جور جنس نر ماده، ۵ دندانه ای، تعدادی از گلها عملاٌ عقیم یا در کپه های ناجور جنس کپه ها با گلهای کناری ماده لوله ای نخی شکل، در بالا ۲ دندانه ای و گل های مرکزی نر ماده و بارور با رأس ۵ دندانه ای یا در کپه های با گل های کناری ماده و گلهای مرکزی عملاٌ نر در بالا ۵ دندانه ای. میوه به شکل فندقه، بدون کرک، بدون کاکل، مستعطیلی باریک، کوچک، با جای زخم ناشی از اتصال لوله گل جانبی و ناف قاعده ای جانبی است. (مظفریان. ۱۳۸۷).
۲-۱-۴-پراکنش جغرافیایی جنس درمنه
گونه های این جنس در اکوسیستم های بسیاری شامل صحرا (A.santolina)، محیط های مرطوب در نزدیکی سطح دریا تا ارتفاعات بالا در حدود ۴۰۰۰ متر (A.melanolepis) رشد می کنند. برخی گونه ها نظیر A.vulgaris در مناطق پوشیده شده از مواد پوسیده و فاسد رشد می کنند .(Cox and Moore 2010)
گونه های درمنه به طور گسترده ای در نیمکره شمالی، (معمولاٌ در زیستگاههای خشک و نیمه خشک) پراکنده شده اند، اما در نیمکره جنوبی تنها در حدود ۱۰ گونه از این جنس یافت شده است (Hayat, Ashraf et al. 2009).
۲-۱-۵-گیاه شناسی گونه درمنه خزری (Artemisia annua)
گیاه درمنه خزری دارای ساقه منفرد به ارتفاع تا ۱۲۰ سانتیمتر با برگ های بدون کرک یا با کرک های پراکنده، برگ های ساقه ای ۲ بار شانه ای بخش، دمبرگ دار با قطعات اصلی جدا از یکدیگر، قطعات شانه ای بخش یا شانه ای منقسم با لوب های سر نیزه ای دندانه دار یا کامل، محور برگ عریان یا با دندانک های کم، برگ های بالای ساقه و لابه لای ساقه ها به تدریج کوچک شده، برگ های روی شخه های گل آذین بسیار کوچک و با تقسیمات خطی تا نخی است. گل آذینها پانیکول گسترده با شاخه های بلند، مورب تا تقریباٌ افقی گسترده دارند.
گل های کناری ماده و زمان گلدهی و میوه دهی در اواخر تابستان تا اواسط پائیز است. رویشگاه گیاه در ایران: شمال، غرب، مرکز و شمال شرق است.
شکل ۲-۲: A. annua
۲-۱-۶-تاریخچه نامگذاری
درمنه از دوران گذشته در طب سنتی دارای اهمیت و مصارف گوناگون بوده است و از آنها با نامهای درمنه، افسنطین، یوشان، برنجاسف، قیصوم و ترخون نام برده شده است و این نامها امروزه نیز در اکثر مناطق متداول است (مظفریان، ولی ا…، ۶۸-۱۳۶۷)
نام Artemisia اولین بار در سال ۱۷۵۳ میلادی توسط لینه برای این جنس انتخاب شد. اقتباس این نام به افتخار زنی است که حدود ۳۲۵ سال قبل از میلاد مسیح می زیسته و همسر حاکم وقت (مازلوس) قسمتی از یونان بود. وی داروساز و گیاهشناس بوده و چندین گیاه را نیز نامگذاری کرده بود.
درمنه، یوشان، ترخ (terekh) این جنس در ایران ۳۴ گونه گیاهی علفی یکساله و چندساله دارد که در سراسر ایران پراکنده اند. گونه های انحصاری آن در ایران عبارتند از A. kermanensis و A.melanolepis و دیگر گونه های آن علاوه بر ایران در قفقاز، سیبری، ترکمنستان، افغانستان، پاکستان، آسیای مرکزی، ارمنستان، آناتولی، عراق، هیمالیا، تبت و اروپا نیز می رویند. پراکندگی جغرافیایی درمنه به وسعت ایران بوده از دشت های پست ساحلی تا ارتفاعات کوهستانی می رویند (مظفریان، و. ۱۳۸۶).
۲-۱-۷- ترکیبات شیمیایی سرده درمنه
مونوترپن های بدون حلقه[۱۶] ، هیدروپراکسید مونوترپن ها[۱۷] ، گلیکوزید مونوترپن های حلقه دار[۱۸] و مونوترپن های غیر معمول در برخی از گونه های درمنه در ایران یافت شده اند (راستیان و مسعودی, ۲۰۱۱).
مهم ترین ترپن در گیاهان سرده آرتمیزنین می باشد که یک سزکویی ترپن لاکتون است. این ترکیب عمدتاٌ در بخش هوایی گیاه یافت می شود (Olofsson, Engstrom et al. 2011).
در سال ۲۰۰۸ در مطالعه ای بر روی A.scoparia، ۲۴ مونوترپن، ۱۹ سزکویی ترپن و ۲ کتون در این گیاه شناسایی شد (Singh, Mittal et al. 2009).
روغن فرار[۱۹] درمنه اغلب حاوی بیش از ۱۰۰ ترکیبجداگانه[۲۰] می باشد، به عنوان مثال در A.siberi بیش از ۱۶۰ ترکیب شیمیایی شناسایی شده است (Rustaiyan and Masoudi 2011).
عمده ترین ترکیبات موجود در روغن بدست آمده از برگ و گل این گیاه شامل : کامفور[۲۱] ، -۱,۸ سینئول[۲۲]، آلفا ترپینولن[۲۳]، آلفا ترپینن[۲۴] می باشد (Movafeghi, Djozan et al. 2010). گیاهان این رده حاوی ترکیبات گلیکونی متعدد هستند. در تعدادی از گونه های این گیاه ۸۰ آگلیکون آزاد[۲۵] شناسایی شده است (Al Hazimi and Basha 2011).
در سال ۲۰۱۰ طی مطالعات صورت گرفته، ۱۸ ترکیب پلی فنلی[۲۶] در برگ های این گیاه شناسایی شد (Carvalho, Teixeira et al. 2011).
در مطالعه ای که بر روی ۱۳ گونه درمنه صورت گرفت اسیدهای چرب غیر اشباع[۲۷] غالب در تمام گونه های درمنه آلفا لینولنیک اسید (ALA) و لینولئیک اسید (LA) تشخیص داده شد (Carvalho, Teixeira et al.2011).
۲-۱-۸- خواص دارویی سرده درمنه:
ترکیبات فنلی بدست آمده از درمنه به عنوان یک مهار کننده پمپ با قابلیت هدف قرار دادن سیستم های جریان[۲۸] در ساختار دیواره باکتریهای گرم مثبت پاتوژن انسانی شناخته شده اند. بررسی های اخیر نشان می دهند که کلرژنیک اسید[۲۹] بدست آمده از A. absinthium دارای خواص ضد میکروبی است (Fiamegos, Kastritis et al. 2011).
کامفور یکی از اجزاء عمده اسانس درمنه است و ار آن در شیمی لاستیک سازی و کاغذ سازی، عطرسازی، لوازم آرایشی، صابون سازی، صنایع چسب، مواد افزودنی، روان کننده، ترکیب رزین ها، حلالها، پلاستیک و رنگها نیز استفاده می شود ۲۰۰۹)، محسن و علی).
۸و ۱ – سینئول به طور گسترده در تهیه مواد دارویی کاربرد دارد. به طور موضعی بعنوان داروی بی حس کننده و ضد عفونی کننده در درمان تورم بکار میرود. سینئول در اسپری های خانگی ، داروهای شستشو و در انواع روغن های پوست و مو مصرف می شود . در مقابل حشرات اثر کشندگی دارد و در تهیه عطر و مواد خوشبو کننده نیز بکار میرود (عبدی و همکاران. ۲۰۱۰).
لیمونن در فراورده های دارویی نظیر قرص بی کربنات سدیم و پمادهای ضد عفونی کننده وارد می شود.در ساخت ویتامین A، نیز از لیمونن استفاده می شود (ایوقی، برزگر و همکاران. ۲۰۱۱).
آرتمیزین برای درمان مالاریا ، عفونتهای انگلی مانند شیستوزوماسیس مورد استفاده قرار میگیرد.این ترکیب همچنین خواص ضد سرطان قوی و گسترده ای را در خطوط سلولی و مدلهای حیوانی نشان داده است(Krishna, Bustamante et al 2008).
اسانس های موجود در گونه های مختلف درمنه در فعالیت های بیولوژیکی مختلفی نقش دارند. فعالیت های بیولوژیکی بعضی از این اسانس ها به طور مستقیم به وسیله بشر تجربه شده است. به عنوان مثال، توجن (Thujone) یک مونوترپن شاخص در بعضی گونه های Artemisia است که باعث ایجاد مسمومیت مزمن می شود. به طوریکه تهیه نوشابه های الکلی از عصاره ریشه گیاه A.absinthium به خاطر وجود این ماده در چندین کشور خارجی ممنوع شده است (۱۴ مقاله). مقدار کل توجن (مشتقات ß-thujone و α) ممکن است تا بیش از ۶۰ درصد کل مقدار اسانس نیز برسد. همچنین ماده تلخ Absinthin استخراج شده از A.absithium خاصیت از بین بردن حشرات و لارو آنها را دارا می باشد.
طی تحقیقاتی که روی ۲۴۰ گونه از تیره Asteraceae جهت تعیین خواص داروئی آن انجام شد، حدود ۸۴ ترکیب دارویی در گونه های Artemisia تشخیص داده شده است. مهمترین گروهسزکویی ترپن ها یافت شده در قبیله Anthemideae شامل لاکتونهای سزکویی ترپن[۳۰] می باشند. این مولکولها به طور وسیعی در طی تحقیقات کموتاکزونومیک (Chemotaxonomic) و سایر مطالعات در جنس Artemisia مورد تحقیق قرار گرفته اند. در حالیکه germacranolides و guaianolides ترکیبات غالب در این قبیله هستند، santanolides به طور اختصاصی در جنس Artemisia گزارش شده است.
گیاه A.annua منبع یک داروی مهم گیاهی سنتی در چین به نام Qing Hao است که در حدود بیش از ۲۰۰۰ سال به عنوان داروی کاهنده تب استعمال می شده است. ترپنوئیدها و فلاونوئیدهای متعدد استخراج شده از A.annua فعالیت ضد سلولی[۳۱] مهمی را در هنگام آزمایش روی تومور در انسان نشان داده است. در بین این مواد، آرتمیزین (Artemisine) و کورستاژتین (Quercetagetin) به عنوان ماده موثر در این فعالیت ضدسلولی مهم اثبات شده اند (۱۷ مقاله). همچنین عصاره های استخراج شده از قسمت های هوایی گیاه A.annua که در مجاورت هوا خشک شده اند، دارای فعالیت تعدیل مصونیت از طریق تکثیر لنفوسیت نوع T بوده اند. بر اساس مطالعات انجام شده ۲۴ ترکیب در اسانس گونه A.annua مشاهده شده است. ترکیبات اصلی این اسانس، آرتمیزیا کتون، ۱و۸- سینئول، پینوکاروون، بتا–سلینن، کامفور و گاما- مورولن می باشند) مینا ربیعی، ۱۳۸۲).
در کشور مجارستان ترکیب های اصلی اسانس گیاه A.annua، آرتمیزیا کتون (Artemisia ketone) و آرتمیزیا الکل (Artemisia alcohol) گزارش شده اند.
ترکیب های اصلی اسانس A.annua رشد یافته از بذور کشور چین شامل آرتمزیا کتون (Artemisia ketone) و آرتمیزیا الکل (Artemisia alcohol)، میرسن (Myrcene)، آلفا – گواین (α- guaiene) و کامفور (Camphor) می باشند. ترکیبهای اصلی اسانس A.annua رشد یافته از بذور کشور ویتنام، کامفور (Camphore) و جرماکرن- دی (germacrene – D) می باشد. بر اساس تحقیقات انجام شده روی اسانس گیاه A.annua در شمال ایران، می توان ترکیبات آرتمیزیا کتون و کامفور را به عنوان ترکیبات اصلی در این گیاه نام برد.
ترکیب شیمیایی بورنئول که تنها در گونه A.annua مشاهده شد، به طور گسترده برای خوشبو کردن انواع محصولات بهداشتی و فراورده های پزشکی استفاده می شود. ترکیب شیمیایی بتا کاریوفیلن که در گونه های A.annua و A.scoparia موجود بوده است، به عنوان طعم دهنده در ادویه، صابون و صمغ آدامس به کار می رود.
یکی از مهمترین ترکیبات دارویی این گیاه، آرتمیزینین[۳۲] از گروه متابولیت های ثانویه موسوم به لاکتون سزکویی ترپن اندوپراکسیدها می باشد که فعالیت مؤثری را برعلیه نژادهای انگل پلاسمودیوم[۳۳] عامل بیماری مالاریا از خود نشان می دهند. از آنجا که در گزارشات سازمان بهداشت جهانی موارد مقاوم این انگل به داروهای فعلی نظیر کلروکوئین، سولفادوکسین و پرپمتامین یافت شده، به همین دلیل تولید تجاری و انبوه آن مورد توجه خاصی قرار گرفته استKalyman , D. L. 1985)). عملکرد نسبتاٌ کم [۰۸/۱ – ۰۱/۰ درصد] این ماده در گیاه محدودیت عمده ای در تولید تجاری آن است. تغییرات در شرایط کشت و محیط رشد در کشت های سلولی و تغییر سطوح هورمون های رشد در کشت بافت به منظور بالا بردن مقدار آرتمیزنین چندان موفق نبوده است و از طرف دیگر به دلیل منابع محدود و مشکلات ساخت مصنوعی – شیمیایی این ماده مورد توجه قرار نگرفته است. به همین دلیل در سالهای اخیر تلاش های زیادی برای افزایش آرتمیزنین از گیاه فوق به کمک الیسیتورها صورت گرفته است(Archana, G. et al. 2002).
تحقیقات جدید در سال ۲۰۰۵ نشان دادند که آرتمیزنین به تنهایی قادر به از بین بردن انتخابی سلولهای سرطانی است. برای مثال مشتقات آرتمیزنین دارای فعالیت ضدتوموری بر علیه سلولهای سرطانی سینه انسان با اثر کشندگی انتخابی می باشند (Singh, N.P. and H .Lai .2001). خاصیت آللوپاتیک (دگر آسیبی در گیاهان) و دورکنندگی حشرات نیز از دیگر اثرات این گیاه است ( Duke, S. et al. 2002).
۲-۲-متابولیت های ثانویه
بشر در طول قرن ها به گیاهان به عنوان منبع کربوهیدرات، پروتئین و چربی وابستگی کامل داشته است. علاوه بر این گیاهان منبع طیف وسیعی از متابولیت های ثانویه می باشند (Ravishankar G. et. Al.). عمدتاٌ یکسری از واکنش های شیمیایی که واسطه آنزیمی دارنددر گیاه زنده به عنوان متابولیسم شناخته می شوند. این واکنش های شیمیایی با هم هماهنگ شده تا مسیرهای متابولیکی که در آنها سنتز مولکولهایی مثل قندها، اسیدهای آمینه، اسیدهای چرب عمده، نوکلئوتیدها و پلیمرهای حاصل از آنها (DNA,RNA) انجام می شود بدست بیایند. این تجمع به عنوان متابولیسم اولیه در نظر گرفته می شود و ترکیب تولید شده که برای زنده ماندن و سالم ماندن گیاه لازم هستند متابولیت اولیه[۳۴] نامیده می شوند. همچنین در گیاهان، مسیرهای متابولیکی دیگری وجود دارد که محصول این مسیرها برای موجود کاملاٌ مشخص نیست که به این ترکیبات متابولیت های ثانویه اطلاق می شود و به مسیر تولید آنها متابولیسم ثانوی گویند. تولید متابولیت های ثانویه بخشی از سیستم دفاعی گیاه را تشکیل می دهد. گرچه محصولات ثانویه گیاهی در گذشته به صورت ترکیبات شیمیایی تعریف می شدند که دارای نقش بیوشیمیایی حیاتی در ساختار و حفظ سلول گیاهی نیستند، تحقیقات اخیر نشان داده که این ترکیبات دارای نقش های حیاتی در اکوفیزیولوژی گیاهان هستند. مسیرهای متابولیکی بخشی از برنامه تکاملی به حساب می آیند و در حقیقت متابولیسم ثانویه نشانه تمایز سلول است و تشکیل متابولیت های ثانویه نشانه اختصاصی شدن سلول هاست (Ram G, Bhan M. et al. 2005).
سه گروه از محصولات ثانویه بر اساس ویژگی های بیوسنتزی وجود دارند. محصولات گیاهی بر اساس نحوه بیوسنتز به ترپن ها، فنلیک و ترکیبات ازت دار تقسیم می شوند. شکل ۱-۴ مسیرهای بیوسنتز محصولات ثانویه و اثرات متقابل آنها با متابولیسم اولیه را به شکل ساده نشان می دهد (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).
شکل ۲-۳- نمای ساده ای از مسیرهای عمده بیوسنتز محصولات ثانویه و ارتباط آنها با متابولیسم اولیه
۲-۲-۱- ترپن ها[۳۵]
ترپن ها یا ترپنوئیدها بزرگترین گروه محصولات ثانویه را شامل می شوند. مواد متنوع این گروه معمولاٌ در آب غیر محلول بوده و به وسیله منشاء بیوسنتزی مشترکشان به هم می پیوندند. ترپن ها از امتزاج واحدهای ۵ کربنی شکل می گیرند که از مسیر موالونیک اسید ساخته می شوند. این مواد سمی هستند و در بسیاری گیاهان به عنوان ترکیبات گیاهی ضد گیاه خواری ایفای نقش می کنند. مثال هایی از انواع ترپن ها عبارتند از: منوترپن ها[۳۶]، سزکویی ترپن ها[۳۷]، دی ترپن ها[۳۸]، تر ترپن ها[۳۹] و پلی ترپن ها[۴۰] (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).
۲-۲-۲- ترکیبات ازت دار[۴۱]
در ساختمان بسیاری از محصولات ثانویه گیاهان ازت وجود دارد. ترکیباتی که در این گروه جای گرفته اند دارای خواص دارویی بوده و بسیار مورد علاقه واقع شده اند (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).
۲-۲-۳- ترکیبات فنلی[۴۲]
گیاهان طیف وسیعی از محصولات ثانویه را تولید می کنند که این ترکیبات دارای یک گروه فنلی می باشند. این ترکیبات به نام ترکیبات فنلی طبقه بندی می شوند. با توجه به تنوع شیمیایی آنها، ترکیبات فنلی نقش های متفاوتی را در گیاهان بازی می کنند. در گیاهان اکثر ترکیبات فنلی از فنیل آلانین و تیروزین مشتق شده اند (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).
۲-۲-۳-۱- فلاونوئیدها
فلاونوئیدها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی و پانزده کربنه گیاهی به همراه دو حلقه آروماتیک (توسط یک پل سه کربنی به یکدیگر متصل می شوند) را تشکیل می دهد این ساختمان از دو مسیر بیوسنتزی جداگانه ایجاد می شود. پل و یک حلقه آروماتیک (حلقهB)، یک واحد فنیل پروپان هستند که از طریق فنیل آلانین ساخته شده در مسیر اسید شیکمیک، ساخته می شوند. شش کربن حلقه آروماتیک دیگر (حلقه A) از سه واحد استات و از طریق مسیر اسید مالونیک نشأت گرفته اند (شکل ۱-۵). فلاونوئیدها موجب انواع اعمال فیزیولوژیکی و اکولوژیکی مختلف در گیاهان می شوند و به عنوان بزرگترین گروه ترکیبات حلقوی اکسیژن دار شناخته شده اند (Kubasek et.al. 1992).
۲-۴- اسکلت پایه فلاونوئید
فلاونوئیدها براساس درجه اکسیداسیون پل سه کربن، به گروه های مختلفی مثل آنتوسیانین ها، فلاون ها، فلاونل ها و ایزوفلاونوئیدها تقسیم می شوند.
آنتوسیانین ها، فلاونوئیدهای رنگی موجود در گل ها و میوه ها هستند که نور ماوراء بنفش را جذب کرده و گیاه را از صدمه توسط این اشعه محافظت می کنند. ایزوفلاونوئیدها گروهی از فلاونوئیدها هستند که به عنوان مواد ضد قارچی و باکتری عمل می کنند. تانن ها ترکیبات پلیمری فنلی هستند که نقش ممانعت از تغذیه گیاه خواران را بر عهده دارند. فلاونوئیدها اعمال مختلفی مانند رنگی شدن و دفاع را در گیاه به عهده دارند (کافی و همکاران. ۱۳۸۲).
۲-۲-۴- نقش متابولیت های ثانویه در گیاهان مولد
متابولیت های ثانویه گروه بزرگی از ترکیبات طبیعی گیاهان را تشکیل می دهند. تنوع شگفت انگیز ساختار شیمیایی ترکیبات ثانوی نتیجه تلاش گیاهان برای ایجاد سازگاری با محیط غیر ثابت و تنش زای اطراف آنها است. به عبارت دیگر این ” تجهیزات شیمیایی” مانع رسیدن آسیب به گیاهان توسط ویروس ها، باکتری ها، قارچ ها یا علف خوار ها می شوند و رقابت آنها با سایر گیاهان را به حداقل می رسانند (Sudha G. et.al 2002). متابولیت های ثانویه از نظر بیولوژیکی و فیزیولوژیکی جزء ترکیبات فعال محسوب می شوند. به طور کلی نقش متابولیت های ثانویه را می توان در موارد ذیل خلاصه کرد:
- جلوگیری از مسمومیت سلول ها توسط برخی ترکیبات حاصل از متابولیسم اولیه
- اعمال برخی اثرات فیزیولوژیکی در بدن موجودات هدف
- به عنوان پیام رسان های شیمیایی به منظور هماهنگ سازی متابولیسم در اندام های مختلف و هماهنگ ساختن فعالیت گیاهان مختلف در بدن یک گونه مشابه
- توسعه پایدار اکولوژیکی (اصغری، غ ر. ۱۳۸۵).
۲-۲-۵- بازار جهانی گیاهان دارویی و معطر
اگرچه طب نوین مستلزم بکارگیری داروهای سنتزی و عوامل میکروبی است سهم عمده ای از صنعت دارویی جهان به منابع گیاهی اختصاص دارد. در حال حاضر بیش از یک چهارم دارو های تجویزی مورد استفاده در کشورهای توسعه یافته به طور مستقیم و غیر مستقیم (نیمه سنتزی) از گیاهان مشتق می شود و فروش سالانه این داروها تنها در کشور امریکا در سال ۲۰۰۲ به بیش از ۳۰ میلیارد دلار بوده است (Fower M. et.al. 2006). از سوی دیگر در کشورهای در حال توسعه از قبیل چین و هند سهم داروهای موجود در بازار به حدود ۸۰ درصد نیز می رسد، مطابق آمارهای موجود ارزش تجاری فراورده های گیاهی در مقایسه با داروهای شیمیایی (با رشد سالانه ۳ تا ۶ درصد) از رشد سالانه ۵ تا ۱۵ درصد برخوردار است و تخمین زده می شود که بازار جهانی این فراورده ها تا سال ۲۰۵۰ به ۵ تریلیون برسد (نوریان، ا. و بشیری صدر، ز. ۱۳۷۹).
۲-۳-معرفی ساختار آرتمیزینین به عنوان یک ترپن مهم
به لحاظ ساختار شیمیایی ،آرتمیزینین یک سزکویی ترپن حاوی یک پل پرکسید غیر معمول است.اعتقاد بر این است که این پراکسید مسئول مکانیزم عمل این ترکیب به عنوان یک ترکیب دارویی می باشد.هیچ ترکیب طبیعی دیگری با چنین پل پرکسید شناخته نشده است. (Eckstein-Ludwig, Webb et al 2003).
اعتقاد بر اینست که بیوسنتز آرتمیزینین از مسیر موالونات (MVA) صورت میگیرد.روشن نیست که آیا مسیر غیر موالونات نیز میتواند با بهره گرفتن از پیش سازهای ، ایزو پنتنیل پیرو فسفات (DMAPP) به بیوسنتز این سزکویی ترپن بپردازد یا خیر(Sawai and Saito 2011).
در مسیر بیوسنتر این ترکیب ، د هیدرو آرتمیزینیک اسید به عنوان پیش ماده نهایی به آرتمیزین تبدیل میشود(Wallart , Pras et al .1999).
شکل۲-۵: مسیر بیوسنتز آرتمیزنین Famesyl diphosphate
۲-۴- کشت بافت گیاهی
۲-۴-۱- طرز تهیه ریزنمونه گیاهی
۲-۴-۱-۱- انتخاب ریزنمونه
ریزنمونه می تواند اندام (ریشه، ساقه، برگ، گل، بذر و پیاز)، بافت (مریستم، پارانشیم) یا سلول (میکروسپور) باشد. ساده ترین نوع کشت، کشت اندام است مانند قلمه ساقه تک گرهی، گل کامل و سخت ترین نوع کشت، کشت سلول در محیط کشت مایع است. ریزنمونه باید از گیاه مادری تهیه شود که عاری از بیماری، دارای برنامه تغذیه مناسب و شبیه به گیاه مادری بوده و در گلخانه یا اتاقک رشدکه دارای شرایط محیطی مناسب است پرورش یافته باشد.
۲-۴-۱-۲- تأثیر مواد گیاهی و عوامل فیزیکی در رشد ریزنمونه
مواد گیاهی می تواند بر رشد و نمو ریزنمونه مؤثر باشد. گیاهان دو لپه ای نسبت به تک لپه ای به محیط درون شیشه اندامهای مختلفی تولید in vitro ای واکنش مثبت تری نشان می دهند. به طور کلی گیاهانی که در محیط می کنند، اگر در محیط درون شیشه ای کشت شوند نیز چنین اندامهایی را تولید می کنند.
سن گیاه نقش تعیین کننده ای را در واکنش ریزنمونه در محیط درون شیشه ای دارد. معمولاً بافتهای جنینی قدرت تکثیر بالاتری نسبت به بافتهای مسن دارند. بافتهای علفی و غیر خشبی نسبت به بافتهای خشبی واکنش مثبت تری نشان می دهند. به طور کلی اندامهای رویشی نسبت به اندامهای زایشی راحت تر تکثیر می شوند.
ریزنمونه ها پس از کشت در اتاقک رشد قرار داده می شوند. در اتاقک رشد ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی تنظیم می گردد. البته بهترین دوره نوری برای ریزنمونه در محیط درون شیشه ای همان دوره نوری است که برای گیاه مادری مناسب است. در مورد بافت های بدون کلروفیل نیازی به وجود نور نیست، در صورتیکه ریزنمونه های کلروفیل دار جهت انجام فتوسنتز نیاز به نور دارند. برخی به غلط تصور می کنند که ریزنمونه در محیط درون شیشه در ظروف Co ۲ در داخل ظرف کشت کم است، در حالیکه میزان Co ای به شدت نور کم نیاز دارد و میزان ۲کشت به اندازه کافی وجود دارد. منبع تأمین نور در اتاقک کشت لامپهای فلورسنت هستند.
دما از دیگر عوامل مهم در اتاقک رشد می باشد. اکثر ریزنمونه های گیاهی در دمایی حدود ۲۵ درجه سانتیگراد به خوبی رشد می کنند. البته گیاهان گرمسیری به دمای بالاتر (۲۹-۲۸ درجه سانتیگراد) و گیاهان پیازی به دمای کمتری (۱۸ درجه سانتیگراد) نیاز دارند.
رطوبت نسبی اتاقک رشد نیز از عوامل مؤثر در رشد ریزنمونه است. معمولاً رطوبت نسبی اتاقک رشد بین ۵۰-۴۰ درصد تنظیم می شود. افزایش رطوبت موجب افزایش آلودگی های قارچی و کاهش آن موجب از دست رفتن آب ریزنمونه می شود.
تهویه مناسب و تأمین اکسیژن عامل مهم رشد سلولها و بافتها است. به همین جهت در صورتی که محیط کشت، مایع باشد باید آن را روی شیکر قرار داد و یا با بهره گرفتن از کاغذ صافی و ایجاد پل کاغذی، اکسیژن محیط کشت را تأمین نمود. در محیطهای کشت جامد با قرار دادن غیر قطبی ریزنمونه (به صورت وارونه) می توان اکسیژن مورد نیاز را تأمین نمود.
چون در محیط درون شیشه ای شدت نور کم و در نتیجه فتوسنتز پایین است، نیازی به افزودن Co2وجود ندارد
ومعمولاً بیشتر نیازگیاه به هیدرات کربن از طریق افزودن ساکارز تأمین می شود.
۲-۴-۲- روش های مختلف کشت بافت گیاهی
کشت بافت گیاهی که انواع روش های کشت گیاهان در شرایط استریل را تحت پوشش قرار می دهد، بایستی در موارد خاص استفاده شود و تقسیم آن به انواع مختلف کشت امکان پذیر است که عبارتند از:
- کشت بذر[۴۳] کشت بذور درون شیشه به منظور تولید گیاهچه یا گیاه کامل.
- کشت جنین[۴۴] کشت جنین جداشده از بالغ یا نابالغ.
- کشت اندام[۴۵] کشت اندام های جداشده گیاهی، که به انواع مختلفی از جمله، کشت در سیستم نوک، کشت ریشه و کشت دانه گرده قابل تقسیم است.
- کشت کالوس[۴۶] کشت یک بافت تمایز یافته از ریزنمونه و اجازه دادن به آن برای تمایز زدایی و تشکیل بافت کالوس.
- کشت سلول[۴۷]کشت سلول های جداشده و یا توده های خیلی کوچک سلولی که در محیط مایع پراکنده می باشد.
- کشت پروتوپلاست[۴۸] کشت پروتوپلاست های گیاهی، یعنی سلول های فاقد دیواره.
۲-۴-۳- کشت کالوس
۲-۴-۳-۱ کالوس
کالوس یا پینه توده سلول پارانشیمی تمایز نیافته است. کالوس می تواند در واکنش به زخم، در محل بافتهای توموری، در محل جوش خوردن پیوند یا در محیط درون شیشه ای تولید شود. کالوس می تواند در تهیه پروتوپلاست، تولید جنین سماتیک، تولید اندامهای ریشه و ساقه و تولید متابولیت های ثانویه مورد استفاده قرار گیرد. برگ، اندام ذخیره ای (پیاز،غده)، گل و میوه از اندامهایی هستند که می توانند برای تولید کالوس مورد استفاده قرار گیرند. از جمله بافتها می توان به بافتهای پیش آوندی، مزوفیل برگ، لپه ها، دایره محیطیه ریشه و لایه آوندی اشاره کرد. معمولاً تشکیل کالوس در گیاهان دو لپه ای بیشتر از گیاهان تک لپه ای است. محیط کشت پایه که غنی از نیتروژن به خصوص نیترات و آمونیوم و فسفات است،LS تغییر یافته و محیط کشتMS یا MSتغییر یافته برای تولید کالوس مورد استفاده قرار می گیرد.
برای تولید کالوس قند های ساکارز یا گلوکز به مقدار ۴-۲ درصد (۴۰-۲۰ گرم در لیتر محیط کشت) به کار می رود. اسیدهای آمینه گلیسین و آرژنین تأثیر مثبتی بر تولید کالوس دارند، همچنین کازئین هیدرولیز شده به محیط کشت اضافه می شود. تنظیم کننده های رشد از جمله اکسین ها و سیتوکنین ها نقش به سزایی در تولید کالوس دارند. غلظت متوسط تا بالای اکسین ها از جمله اسید نفتالین استیک، اسید ایندول استیک و ۲,۴-D برای تولید کالوس ضروری است. از جمله سیتوکنین ها می توان به کینتین و بنزیل آدنین اشاره کرد که با غلظت کمتری نسبت به اکسینها، مورد استفاده قرار می گیرد.
محیط کشت جامد برای کشت کالوس دارای معایبی به شرح ذیل است:
- در محیط کشت جامد، توده کالوس در سطح محدودی با محیط کشت در تماس است، در نتیجه مواد کمتری از محیط کشت جذب می کند و تعادلی در رشد در اثر مواد غذایی جذب شده، گازهای تبادل شده و فرآورده های پس مانده سمی بین کالوسو محیط کشت وجود ندارد.
- در محیط کشت جامد تأمین اکسیژن کمتر از محیط کشت مایع است.
- توده های کالوس در محیط کشت مایع به قطعاتی تقسیم می شوند و در سطح بیشتری تولید می شوند، در نتیجه جذب مواد غذایی از محیط کشت افزایش می یابد که در محیط کشت جامد چنین نیست.
- در محیط کشت جامد، افزودنیهایی وجود دارد که باعث تسریع در تمایز می شوند و از رشد کالوس جلوگیری می کنند.
واکشت کالوس یعنی انتقال کالوس از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر که به دلایل زیر صورت می گیرد:
- تجمع مواد زائد در محیط کشت.
- تخلیه مواد غذایی محیط کشت.
- خشک شدن محیط کشت.
معمولاً اگر دمای اتاق رشد حدود ۲۵ درجه سانتیگراد باشد هر ۶-۴ هفته یکبار لازم است کالوس به محیط جدید منتقل شود. کالوس ها پس از واکشتهای مکرر قادر به تأمین اکسین و سیتوکنین بوده و از این نظر خودکفا می شوند که به آن عادت کردن می گویند.
کالوسها از نظر رنگ و برخی صفات دیگر می توانند متفاوت باشند.کالوس ها از نظر رنگ به دو دسته تقسیم می شود: کالوس های تیره که دارای سایه های کرم، زرد، بژ یا قهوه ای می باشند و کالوسهای روشن که گاهی اوقات (نه همیشه) سبز هستند و ممکن است دارای رنگدانه های قرمز (آنتوسیانین) یا تیره (ترکیبات فنولی) باشند.
از نظر بافت نیز کالوس ها متفاوت بوده و برخی نرم و براحتی قابل جدا کردن هستند (کالوس هویج) و برخی سفت و محکم هستند (کالوس آنتوریوم). از نظرسرعت رشد نیز، کالوس ها متفاوتند و معمولاً بعد از گذشت یک تا چند هفته مقدار کالوس قابل مشاهده است. معمولاً مدت زمان دوبرابر شدن یک توده کالوس مستقر شده یک هفته یا بیشتر می باشد.
شاخص های متعددی برای ارزیابی کالوس ها وجود دارندکه از جمله آنها می توان به وزن تر، درصد وزن خشک، شمارش تعداد سلول، شاخص میتوزی کالوس و شاخص تنفس کالوس اشاره کرد.
۲-۴-۴- هورمونهای گیاهی
۲-۴-۴-۱- اکسین ها
اکسی
